Die Geschichte des Chors reicht weit zurück: In früheren Jahrhunderten war er mit der seit der Reformationszeit bestehenden Lateinschule der Stadt verbunden, dem heutigen Alten Gymnasium. Dort waren die Kantoren von Sankt Nikolai als Lehrer tätig und verbrachten einen Großteil ihrer Dienstzeit.

Heute umfasst der Sankt Nikolai-Chor ca. 90 Sängerinnen und Sänger, die zwischen Ost- und Nordsee aus den Regionen beiderseits der deutsch-dänischen Grenze kommen.

Besondere Attraktivität besitzt der Chor durch die intensive stimmbildnerische Arbeit. Dadurch können Choristen immer wieder auch solistische Aufgaben übernehmen und in kleinen kammermusikalischen Besetzungen (siehe auch Capella Sankt Nikolai) musizieren.

Der Sankt Nikolai Chor zieht zu seinen Konzerten und bei Veranstaltungen von Kirchenkreis und Nordelbischer Kirche Zuhörer aus dem ganzen Landesteil Schleswig sowie aus dem Süden Dänemarks an.

Die Kooperation mit den dänischen Gemeinden dies- und jenseits der Grenze ist dem Sankt Nikolai-Chor wichtig. Im Laufe der vergangenen Jahre hat sich so die Tradition entwickelt, gemeinsam mit dem Chor der dänischen Helligåndskirken in der Weihnachtszeit ein gemeinsames Konzert zu veranstalten. 2004 gab der Sankt Nikolai-Chor ein Passionskonzert im dänischen Tønder, im September 2005 war der Chor mit einem à-cappella-Programm in Løgumkloster zu Gast. Im Dom zu Haderslev wurde im September 2006 die »Marienvesper« von Claudio Monteverdi aufgeführt.

Trotz zahlreicher Konzerte und Aufführungen der »großen« Kirchenmusik ist der Sankt Nikolai-Chor ein gottesdienstlicher Chor der Flensburger Sankt Nikolai-Kirche.

Regelmäßig wirkt er in den Gottesdiensten mit – und das nicht nur an hohen Festtagen, sondern auch an »normalen« Sonntagen. Gemeinsam mit den Pastoren und dem Organisten trägt er das Geschehen im lutherischen Gottesdienst.

Auch Chorreisen sind ein fester Bestandteil des Chorlebens an St. Nikolai:

Konzertreisen führten den Chor 1997 nach Österreich, 2001 in die Flensburger Partnerstadt Carlisle in Nordengland, 2004 in die Südpfalz sowie ins Elsass und im Oktober 2007 in den Harz, mit Stationen in Leipzig (Thomaskirche), Halle (Marktkirche) und im Naumburger Dom.

Im Oktober 2010 konzertierte der Chor in Riga – mit dem Requiem von Mozart in der Latvian Society Hall, sowie mit der Messe in D von Antonin Dvorak im Dom zu Riga.

Die Konzertreise 2013 führte im Oktober nach Ulm. Im Rahmen der Johann-Nepomuk-David-Tage 2013 sang der Sankt Nikolai Chor im Ulmer Münster die „Missa Choralis de Angelis“
 des österreichischen Komponisten sowie Werke von Josef Rheinberger und Knud Nystedt.